培养细胞如何提取mRNA,如何逆转录?培养细胞提取mRNA的原理是什么？如何用所提取的mRNA进行逆转录？
<p>问题：培养细胞如何提取mRNA,如何逆转录?培养细胞提取mRNA的原理是什么？如何用所提取的mRNA进行逆转录？<p>答案：↓↓↓<p class="nav-title mt10" style="border-top:1px solid #ccc;padding-top: 10px;">付岩的回答：<div class="content-b">网友采纳 1细胞总RNA的提取 1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时,取出无菌室,去其上清,用PBS洗两次后,每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司）1ml,摇匀,无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠,细胞脱壁）. 2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5mlEP管中,加新开的氯仿0.2ml,轻摇15秒. 3）、室温静置2-3分钟后,12000rpm,15min,4℃,离心.然后取上清无色水相（约0.6ml）到EP管（DEPC处理过）,加0.5ml新开的异丙醇,室温下静置10分钟. 4）、12000rpm,10分钟,4℃,离心.观察总RNA在管底的白色沉淀,弃去上清（小心别丢了沉淀）,75%乙醇1.0ml洗涤（用DEPC水新配制）后,7500rpm,5min,4℃离心. 5）、去上清,点离,用小Tip吸干液体.气干沉淀5-10分钟,DEPC处理水20-30ul加入,中枪打匀,55-60℃水浴10分钟溶解总RNA,测OD值. 6）、电泳. 2从总RNA中分离mRNA（OligotexmRNAMiniKit,Cat.no.:70022,QIAGEN） 1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25mg）到一个新的无RNase的EP管中,用无RNase的水定容到250ul. 2）、加入BufferOBB250ul,OligotexSuspension15ul.用Tip打匀或用手弹匀. 3）、70℃水浴,3分钟（裂解RNA的二级结构）. 4）、20-30℃条件下,静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）. 5）、高速离心2分钟,小心吸走上清（该上清要保留）,留下约50ul的上清在原管里. 6）、用BufferOW2400ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀,然后将这些加到套有1.5mlEP管的SPIN柱子上,高速离心1分钟. 7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加BufferOW2400ul到柱子,高速离心1分钟,丢掉滤过液. 8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加20-100ul热的（70℃）BufferOEB到柱子上,用Tip来回吸打3-4次,高速离心1分钟. 9）、为保证最大的mRNA产量,可再次重复第8步. 10）、电泳. RNA提取的原理就是核酸在异丙醇中的溶解度很低!其他步骤都是防止RNA降解和使RNA从细胞中溶出. 逆转录过程请看参考资料.
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